pCold-SUMO 原核蛋白表达试剂盒

原核蛋白表达试剂盒简介       【*  4000/盒     】

         本试剂盒所包含的原核表达载体（pCold-SUMO）是在pCold载体基础上改造而成（Solarbio ），该载体启动子（CS Promoter）来源于南极嗜冷细菌

，在低温下（15度）才能启动蛋白的表达。低温下细菌生长缓慢，使得蛋白合成速度减慢，从而大限度的提高了蛋白正确折叠的几率，提

高了蛋白可溶性表达，增强了活性蛋白的表达比率。该表达系统所包含的SUMO tag可以极大地提高小分子量蛋白的表达量，而且进一步提

高了蛋白的可溶表达几率。同时，试剂盒配备的SUMO Protease（含6×His标签）可特异性去除SUMO tag，从而得到不含任何标签的重组蛋白。

原核蛋白表达试剂盒操作方法

       I. 重组质粒构建

1.根据目的基因选择合适的酶切位点，将pCold-SUMO载体和插入片段分别进行双酶切

2.酶切完成后 经1％琼脂糖凝胶电泳，将线性载体进行凝胶回收（Solarbio, D1200） 。

3.连接反应（以SolarbioT4连接酶为例）

4.取5 μl连接产物转入*0 感受态细胞（Solrbio ,C1200） ，通过测序鉴定重组质粒。

II. 重组蛋白表达

1. 将重组质粒转入表达宿主菌ArcticExpress或BL21（DE3）、BL21（DE3）plys、Origami等感受态细胞）。

2. 挑选生长良好的菌落，接入LB培养基（含40-100ug/ml氨苄青霉素），37℃剧烈振荡培养至OD600=0.2-0.6。

4. 待培养基冷却至15℃后，再静置30min。

5. 加入适量IPTG（0.1-1 mM）,15℃振荡培养24h。

6. 4,000 rpm室温离心15min，收集细胞。

7. 用重悬液重悬细胞（含PMSF或Protease Inhibitor Cocktail），并置于冰上破碎。

8. 破碎后使用SDS-PAGE胶检测蛋白的表达及可溶性表达情况。

III. 蛋白纯化

1.融合SUOM标签的重组蛋白含有6×His标签，重组蛋白可通过Ni-NTA Resin（Solarbio, C0401）进行纯化。详细的纯化操作步骤请参考Solrbio Ni-NTA

Resin（Solarbio ，C0401）说明书。

2.SUMO标签分子量为15KD。融合SUOM标签的重组蛋白可通过SUMO Protease切割去处SUMO标签，SUMO Protease切割位点见图谱。切割后

SUMO标签含6×His标签、目的蛋白不含有6×His标签，所以可通过Ni-NTA Resin（Solarbio, C0401） 将SUMO标签和未*切割的融合蛋白

与不含SUMO标签的目的蛋白分离纯化。

3.本SUMO Protease蛋白分子量为31KD,并含有6×His标签可通过Ni-NTA Resin去除。

注意：对于大部分融合蛋白，SUMO Protease的理想反应液中的NaCl浓度为150mM。然而，根据实际情况可在100 mM～300 mM之间调节NaCl

的浓度以达到佳效果。若蛋白为热不稳定性，请在4°C孵育较长时间或增加酶的用量。

（2）. 混匀上述体系后于30°C 孵育，在1、2、4、6小时分别吸出30 μl上述反应液，分别置于EP管中。

（3）. 向上述EP管中加入6 μl 5XSDS Loading Buffer，置于-20°C。

（4）. 取30 μl样品进行SDA-PAGE 分析。

原核蛋白表达试剂盒